人肺微血管內皮細胞

人肺微血管內皮細胞需要準備好細胞所要用到的培養基和相關試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培養條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導致對細胞處理不當，  或者環境的不適應而造成細胞的死亡。
人肺微血管內皮細胞培養物的生理環境不同時定義為其物理化學環境中，更好地理解血清的組件，所必需的增殖的生長因子的鑒定，并更好地理解細胞在培養的微環境（即，細胞 - 細胞相互作用，氣體的擴散，與基質相互作用）現在允許在無血清培養基中某些細胞系的培養。
培養物的主要優點是操縱物理化學（即，溫度，pH，滲透壓，O2和CO2張力）和生理環境（即，激素和營養物濃度），其中所述細胞繁殖的能力。除溫度，將培養環境是由生長培養基進行控制。
對于培養，只要我們細心操作，注意細節，并不是大家說的那樣困難。對于有經驗和有條件的客戶，建議由公司代為培養細胞及進行后續研究。

細胞復蘇技術：

1. 取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍

2. 吸出細胞懸液,并加10倍以上培養液

3. 1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清

4. 用培養液適當稀釋后接種培養瓶,放入37℃ CO2培養箱靜置培養

5. 鏡檢細胞貼壁能力，次日更換一次培養液,繼續培養

培養方法：

收到細胞后，在倒置顯微鏡下觀察整個細胞生長情況：

如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內，嚴格無菌操作，打開細胞培養瓶，留10ml培養液繼續培養。

如果細胞已長滿（達80-90%）。即可進行傳代，具體步驟如下：

a，棄去培養液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶內加入1.0-2.0ml酶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養液，輕輕吹打細胞。

c，加入等量的的培養液，輕輕吹打混勻后吸出一半，分到新的培養

d，傳代比例：1:2-1:3

保存和應用：

客戶可以根據自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細胞，如是新鮮原代細胞，客戶收到細胞后應立即將其放入CO2細胞培養箱內靜置后2-3h，再進行后續的實驗操作。如是凍存細胞，客戶收到細胞后應立即將其放入液氮、-80℃冰箱或立即進行復蘇。

細胞復蘇的原則：

在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。

1）該細胞只能用于科研，不得用于臨床。

2）收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們聯系。

3）仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等。

4）用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題貼壁細胞會有少量從瓶壁脫落，將細胞置于培養箱內靜置培養過夜，隔天再取出觀察。此時多數細胞均會貼壁，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍染色測定細胞活力，如果證實細胞活力正常，請將細胞離心后用新鮮培養基再次貼壁培養；如果染色結果顯示細胞無活力，請拍下照片及時和我們聯系，信息確認后我們為您再免費寄送一次。

5）請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。培養瓶內多余的培養基可收集備用，細胞傳代時可以一定比例和客戶自備的培養基混合，使細胞逐漸適應培養條件;建議直接購買我司提供的培養基。

6）建議客戶收到細胞后qian3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和我司技術部溝通交流。

細胞培養操作

1）復蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液培養瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2 min（視細胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加2-3ml培養基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養液后吹勻。

c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養基的新皿中或者瓶中，置于培養箱中培養。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例；

a、收集細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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